Method for biosynthesis of specific isotope-marked secondary metabolites

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biosynthese von spezifisch isotopenmarkierten Sekundärmetaboliten. Zielsetzung der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung eines Verfahrens zur spezifischen Markierung von mikrobiellen Sekundärmetaboliten mit stabilen oder radioaktiven Isotopen, mit dem unter stark reduziertem Einsatz markierter Vorstufen höchste Einbau- und Markierungsraten erzielt werden können. Erfindungsgemäß werden mittels gentechnischer Methoden im Genom von bakteriellen bzw. pilzlichen Sekundärmetabolitproduzenten Gene der Aminosäurebiosynthese ausgeschaltet, deren Endprodukte (Aminosäuren) als Donoren funktioneller Gruppen von Sekundärmetaboliten dienen bzw. teilweise oder vollständig in die Molekülstruktur von Sekundärmetaboliten integriert werden. Der Einsatz isotopenmarkierter Substanzen erfolgt dabei wesentlich gezielter als bei dem gegenwärtig eingesetzten Verfahren zur Totalmarkierung, welches auf einer Zugabe von markierten Aminosäuren in ein Kulturmedium beruht. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur gezielten Markierung einer Vielzahl von Naturstoffen, eingesetzt werden. Die besondere Bedeutung des Verfahrens liegt dabei in der Herstellung preiswerter, verlässlicher Referenzsubstanzen/Standards für die moderne, hochsensitive Analytik-Verfahren wie SIDA-MS/MS. The invention relates to a method for biosynthesis of specific isotope-marked secondary metabolites. The invention addresses the problem of developing a method for specific marking of microbial secondary metabolites having stable or radioactive isotopes, by means of which maximum installation and marking rates can be achieved via strongly reduced use of marked precursors. According to the invention, genes of amino acid biosynthesis in the genome of bacterial or fungal secondary metabolite producers are deactivated by means of genetic engineering methods, the final products (amino acids) of which serve as donors of functional groups of secondary metabolites and are partially or completely integrated in the molecular structure of secondary metabolites. The use of isotope-marked substances occurs substantially more specifically according to the invention than in the currently used method of total marking, which is based on an addition of marked amino acids to a culture medium. The method according to the invention can be used for specific marking of a plurality of natural substances. The particular significance of the method lies in the production of inexpensive, reliable reference substances/standards for modern, highly sensitive analytics methods such as SIDA-MS/MS. L'invention concerne un procédé de biosynthèse de métabolites secondaires marqués spécifiquement par des isotopes. L'invention vise à développer un procédé de marquage spécifique des métabolites secondaires microbiens par des isotopes stables ou radioactifs, qui permette d'atteindre des taux d'incorporation et de marquage les plus élevés possible tout en réduisant fortement le recours à des étapes de pré-marquage. Le procédé selon l'invention consiste à neutraliser au moyen de méthodes génétiques dans le génome de producteurs de métabolites secondaires bactériens ou fongiques les gènes de la biosynthèse des acides aminés, dont les produits finaux (acides aminés) servent de donneurs de groupes fonctionnels de métabolites secondaires ou sont en partie ou en totalité intégrés dans la structure moléculaire de métabolites secondaires. L'utilisation de substances marquées par des isotopes se fait alors sensiblement de manière plus ciblée que dans le cas du procédé de marquage total utilisé actuellement, qui repose sur l'addition d'acides aminés marqués dans un milieu de culture. Le procédé selon l'invention peut être utilisé pour le marquage ciblé d'une pluralité de substances naturelles. L'importance particulière du procédé réside dans la production de substances de référence/de normes économiques et fiables pour des procédés d'analyse modernes hautement sensibles, par exemple les procédés d'analyse SIDA-MS/MS.